E. coli Nissle 1917 diseñada para la administración de IL bioactiva

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12506 (2023) Citar este artículo

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En este estudio realizamos una optimización paso a paso de la IL-2 biológicamente activa para su administración utilizando E. coli Nissle 1917. La ingeniería de la cepa se combinó con un ensayo celular in vitro para medir la actividad biológica de la IL-2 producida microbianamente (mi -IL2). A continuación, evaluamos el potencial inmunomodulador de mi-IL2 utilizando un modelo de esferoide tumoral 3D que demuestra un fuerte efecto sobre la activación de las células inmunitarias. Finalmente, evaluamos las propiedades anticancerígenas de la cepa diseñada en un modelo de tumor CT26 murino. La cepa diseñada se inyectó por vía intravenosa y colonizó selectivamente los tumores. El tratamiento fue bien tolerado y los tumores de los ratones tratados mostraron una modesta reducción en la tasa de crecimiento del tumor, así como niveles significativamente elevados de IL-2 en el tumor. Este trabajo demuestra un flujo de trabajo para investigadores interesados en diseñar E. coli Nissle para una nueva clase de terapia microbiana contra el cáncer.

En las últimas décadas se han logrado avances significativos en terapias que aprovechan el sistema inmunológico para combatir el cáncer. A diferencia de la quimioterapia o la radioterapia, los fármacos de inmunoterapia no son directamente tóxicos para las células cancerosas. En cambio, estos medicamentos activan las células inmunitarias o las dirigen para que reconozcan y eliminen las células cancerosas. Debido a su eficacia, la inmunoterapia se está convirtiendo rápidamente en un potente tratamiento de primera línea contra el cáncer1. Curiosamente, los orígenes de esta modalidad de tratamiento se remontan al siglo XVIII. Las primeras observaciones reportadas se realizaron después de que pacientes con cáncer con infecciones bacterianas mostraran una regresión tumoral significativa2. A estas observaciones siguieron intentos de crear terapias basadas en bacterias para tratar el cáncer, pero los resultados de estos estudios no fueron concluyentes3. Aunque se abandonó el concepto de utilizar bacterias para modular la respuesta inmune, estos experimentos proporcionaron las primeras demostraciones crudas de un intento de tratar el cáncer aprovechando el sistema inmunológico mediante terapias basadas en bacterias.

Recientemente se ha producido un resurgimiento de las estrategias de inmunoterapia basadas en bacterias tras la observación de que bacterias específicas pueden colonizar tumores de forma selectiva cuando se inyectan por vía intravenosa4,5. A pesar de la amplia evidencia preclínica6,7,8, la traducción de inmunoterapias bacterianas a humanos aún no se ha materializado. Sin embargo, los avances en biología sintética proporcionan los medios para modificar estas bacterias que se alojan en tumores para mejorar sus capacidades para aplicaciones terapéuticas.

El uso de microbios modificados genéticamente para aplicaciones terapéuticas, también llamados Terapéuticas Microbianas Avanzadas (AMT), es una estrategia prometedora para la administración local de moléculas y proteínas bioactivas en el cuerpo humano. Las bacterias pueden colonizar y vivir en diferentes sitios del cuerpo humano, como la piel, el intestino e incluso tumores9. De esa manera, Salmonella typhimurium ha sido ampliamente estudiada para la producción de compuestos bioactivos en el microambiente tumoral10,11,12,13. Esto es especialmente útil para la administración local de proteínas con una vida media corta o proteínas que son demasiado tóxicas para usarse sistémicamente. Una de esas clases de proteínas son las citoquinas14.

Las citoquinas son pequeñas proteínas de señalización que ayudan a coordinar la respuesta inmune. Comprenden una gran familia de proteínas secretadas por varios tipos de células y ejercen efectos de señalización tanto en las células inmunitarias como en otros tipos de células14. La citocina IL-2 es un potente factor de crecimiento de las células T y de las células asesinas naturales (NK)15,16. La estimulación de IL-2 es crucial para la activación y diferenciación de células T y células NK hacia un fenotipo citotóxico y efector. Las células T CD8+ y las células NK son células efectoras clave que participan en la destrucción directa de las células cancerosas. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que las células T CD4+ también desempeñan un papel clave en el apoyo a la actividad antitumoral de las células T CD8+ al producir citocinas necesarias para su activación y diferenciación, así como al matar directamente las células cancerosas tras el reconocimiento de antígenos tumorales en el contexto de complejo mayor de histocompatibilidad II17,18. Por lo tanto, la IL-2 es un factor de estimulación clave para impulsar la citotoxicidad de las células inmunitarias hacia las células cancerosas. Sin embargo, el uso clínico de la IL-2 es limitado debido a su alta toxicidad sistémica, su corta vida media en plasma y su escasa penetración en el área diana19,20.

La administración intratumoral de IL-2 mediante microbios modificados se ha estudiado previamente utilizando especies de Salmonella typhimurium21 y Clostridium22,23. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la bacteria probiótica Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) también puede colonizar tumores y puede presentar un mejor perfil de seguridad que S. typhimurium24. Además, las cepas de E. coli se han utilizado previamente para administrar péptidos terapéuticos in vivo en el microambiente del tumor25,26,27.

En este estudio presentamos un AMT diseñado para la administración local de IL-2 directamente en tumores sólidos utilizando el probiótico EcN. Realizamos una optimización de la cepa para aumentar la producción de proteína IL-2 bioactiva fuera de la célula. Se realizaron varias rondas de optimización y se determinó la capacidad del candidato más prometedor para estimular la citotoxicidad de las células inmunitarias con un ensayo de esferoides tumorales en 3D. Finalmente, las propiedades anticancerígenas de la cepa más prometedora se validaron in vivo utilizando un modelo animal de carcinoma de colon singénico CT26. Los resultados demostraron la capacidad de la cepa optimizada para modular el microambiente tumoral duplicando los niveles intratumorales de IL-2 y ralentizando moderadamente la tasa de crecimiento de los tumores.

Se han explorado las bacterias gramnegativas por su capacidad para colonizar y proliferar en el microambiente tumoral4,5. En este estudio, elegimos el probiótico EcN como cepa plataforma para diseñar la capacidad de administrar IL-2 directamente en el microambiente del tumor. En EcN, SecB es la vía de secreción dominante, que realiza la translocación de proteínas desplegadas prematuramente al periplasma, donde tiene lugar el plegamiento de proteínas28. En consecuencia, elegimos el péptido señal de OmpA dependiente de SecB como nuestra cepa de referencia, ya que esta etiqueta se ha utilizado previamente para la translocación de proteínas al entorno extracelular29. A continuación, clonamos múltiples péptidos señal SecB (Tabla 1) en el extremo N de IL-2 (Fig. 1A). Las construcciones también albergaban una etiqueta de hexahistidina (His6) C-terminal para la purificación y cuantificación. De todos los péptidos señal investigados, sólo LamB mostró una mejora en los títulos extracelulares de IL-2 en comparación con la construcción inicial con el péptido señal OmpA (barras rojas de la Fig. 1A).

La optimización del péptido señal y la etiqueta de solubilidad conduce a una mayor producción y actividad de citoquinas en el sobrenadante. (A) Se clonaron diferentes péptidos señal aguas arriba del gen IL-2-His6. Se recogieron los sobrenadantes bacterianos y se midieron los niveles de IL-2 en el sobrenadante usando un kit ELISA de IL-2 (indicado en rojo). La actividad de IL-2 en los sobrenadantes se midió usando el ensayo de actividad CTLL-2. Se muestran las UFR normalizadas para bacterias que no expresan (indicadas en azul). (B) La etiqueta de solubilidad de InfB se clonó en el extremo N o C de la citocina. Se recogieron los sobrenadantes y se midió la señal de IL-2 mediante ELISA (indicado en rojo). La actividad de IL-2 en los sobrenadantes se midió usando un ensayo de actividad CTLL-2. Se muestran las UFR normalizadas para bacterias que no expresan (indicadas en azul). Se muestran los valores de tres réplicas biológicas con desviaciones estándar. *Se eligió la cepa LamB con la etiqueta InfB C-terminal para experimentos adicionales. Unidad fluorescente relativa RFU, sitio de unión al ribosoma RBS, péptido señal péptido Sig, etiqueta de hexahistidina His6.

Si bien los títulos de proteínas son una buena medida para impulsar la optimización de la cepa, no necesariamente se correlacionan con la actividad de la proteína expresada. Por lo tanto, es necesario medir la actividad de las proteínas para determinar la cantidad de proteína funcional que se está produciendo. La actividad de IL-2 se midió con un ensayo de actividad utilizando células CTLL-2, que determina los niveles de IL-2 activa de manera dependiente de la dosis. Curiosamente, observamos que los niveles de proteína de IL-2 no se correlacionaban con los niveles de actividad determinados con células CTLL-2 (Fig. 1A, barras azules). Si bien OmpC demostró títulos bajos de IL-2, retuvo la misma actividad biológica que la cepa OmpA de referencia. Por el contrario, el uso del péptido señal LamB condujo a un aumento de ~50 % en los títulos de IL-2; sin embargo, la actividad de la proteína no aumentó de la misma manera. Estos hallazgos sugieren una alta variabilidad en la cantidad de IL-2 biológicamente activa producida en el sobrenadante de las diferentes construcciones de expresión. Además, las cepas exhibieron una carga metabólica diferente, que no se correlacionó con la cantidad de IL-2 producida en los medios (Figura complementaria S1A).

Especulamos que los títulos bajos de IL-2 pueden haber sido una consecuencia de la agregación de IL-2 mal plegada en cuerpos de inclusión, un problema común cuando se expresan proteínas heterólogas en E. coli33. Por tanto, se seleccionaron seis cepas para mejorar el plegamiento de proteínas y la actividad de la IL-2 producida por diferentes péptidos señal (OmpA, LamB, OmpF, OmpC, PhoA y OmpT). Clonamos la etiqueta de solubilidad de InfB en el extremo N o C de IL-2 (Fig. 1B). La adición de la etiqueta de solubilidad de InfB generalmente condujo a títulos más altos de producción de IL-2 en el sobrenadante. La cepa OmpA con InfB C-terminal mostró la mayor mejora, con un aumento de ocho veces en los niveles totales de proteína IL-2 en el sobrenadante (barras rojas de la Fig. 1B). Las cepas OmpC y LamB con InfB N-terminal también mostraron niveles más altos de IL-2, con un aumento de 3,5 y cinco veces respectivamente. Si bien OmpA con etiqueta de solubilidad InfB C-terminal tenía la mayor cantidad de IL-2 total, mostró niveles bajos de actividad de IL-2, lo que indica que la mayor parte de la citoquina producida está inactiva (barras azules de la Fig. 1B). Curiosamente, las cepas que mostraron una mayor producción activa de IL-2 fueron PhoA con InfB N-terminal y LamB con etiqueta InfB C-terminal. Sin embargo, la cepa PhoA mostró una alta variabilidad en el rendimiento del crecimiento y tuvo un mayor costo de aptitud física (Figura complementaria S1B). Teniendo en cuenta tanto la aptitud de la cepa como la producción activa de IL-2, se seleccionó la cepa LamB con InfB C-terminal como la candidata más prometedora.

Finalmente, la construcción LamB con la etiqueta de solubilidad InfB C-terminal se clonó bajo la expresión de diferentes promotores (Tabla 2, Figura complementaria S2). Seleccionamos los promotores constitutivos MS6 y MS8 ya que son parte de una biblioteca desarrollada previamente para una expresión consistente in vivo (Armetta et al. 202135). El cambio del promotor no provocó ningún aumento en los títulos o la actividad de IL-2, pero sí impuso un costo de aptitud física a las cepas (Figura complementaria S1C). Por tanto, continuamos con la cepa utilizando el promotor Anderson J23107. En general, elegimos esta cepa porque era capaz de producir altos niveles de IL-2 funcionalmente activa sin comprometer significativamente la aptitud de la cepa. De ahora en adelante, nos referiremos a la IL-2 producida microbianamente a partir de la cepa LamB-InfB optimizada como mi-IL2.

La IL-2 es una citoquina fundamental para la activación de células inmunes que matan el cáncer, como las células T CD8+ y las células NK36,37. Así, la IL-2 promueve una respuesta inmunológica al inducir la producción de proteínas, que participan en la citotoxicidad mediada por contacto directo, como granzimas, perforina y ligando Fas (FasL)38,39. Determinar la capacidad de mi-IL2 para inducir una respuesta inmune antitumoral, se estableció un ensayo de esferoides tumorales 3D. El sobrenadante de la cepa mi-IL2 se incubó con células inmunes humanas (PBMC) y un único esferoide tumoral HT29. Se añadió mi-IL2 a los cocultivos a una concentración final de ~ 1 ng/ml. Se utilizó IL-2 purificada o sobrenadante de bacterias que no se expresan como control positivo y negativo (Neg.Ctrl), respectivamente. La IL-2 purificada mostró una activación dependiente de la dosis de la citotoxicidad de las células inmunes y la desestabilización de los esferoides (Fig. 2A, B). Después de 72 h, las PBMC expuestas a mi-IL2 indujeron los mismos niveles de toxicidad que la IL-2 purificada. Además, el análisis visual de la integridad del esferoide tumoral con mi-IL2 mostró resultados similares a 10 ng/ml de IL-2 (Fig. 2B).

La expresión genética asociada con la citotoxicidad mediada por células inmunitarias es inducida por el sobrenadante de mi-IL2. (A) La citotoxicidad se midió a partir de cocultivos expuestos a IL-2 purificada o sobrenadante de mi-IL2 utilizando Cytotox Green y el sistema de imágenes Incucyte. Se analizaron tres esferoides para cada condición. Se utilizó sobrenadante de bacterias que no expresaban como control negativo (Neg.Ctrl). (B) Imágenes representativas de la integridad del esferoide después de 3 días de cocultivo. (C) Análisis por RT-qPCR de genes de respuesta a IL-2 de esferoide tumoral y cocultivo de PBMC. La expresión génica se normalizó a la expresión de GAPDH. Se muestran los valores medios de expresión genética relativa y SEM de tres experimentos independientes. Las secuencias de cebadores de qPCR se enumeran en la Tabla 3. (D) Niveles de IFNγ de los cocultivos de esferoide tumoral y PBMC. Los niveles de proteína se midieron mediante ELISA. Se muestran los valores medios de los niveles de proteína y SEM de tres experimentos independientes. Significancia determinada con ANOVA y análisis post-hoc de comparación entre grupos utilizando la prueba de diferencia significativa honesta de Tukey: (ns) p > 0,05, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001.

A continuación, queríamos investigar si a nivel molecular mi-IL2 induciría la expresión de genes asociados con la citotoxicidad mediada por células inmunitarias mediante el mismo mecanismo que la IL-2 purificada. Por lo tanto, determinamos el perfil de expresión génica en los cocultivos de esferoides tumorales y PBMC después de 24 h de exposición mediante RT-qPCR (cebadores enumerados en la Tabla 3). La IL-2 purificada mostró una regulación positiva dependiente de la dosis de genes asociados con la destrucción de células inmunitarias (Fig. 2C). 10 ng/ml de IL-2 aumentaron significativamente la expresión de IFNG, FASLG, GZMA y PRF1, mientras que la exposición a 1 ng/ml de IL-2 purificada condujo a niveles más bajos de expresión de estos genes. Curiosamente, los cocultivos expuestos a mi-IL2 condujeron a una fuerte firma de activación genética similar a los 10 ng/ml de IL-2 purificada. Esto fue inesperado, ya que la concentración total de mi-IL-2 era aproximadamente 10 veces menor, pero las células mostraron una mayor regulación positiva de los genes diana. En general, mi-IL2 parece promover una activación del gen diana más fuerte de lo que se esperaría según su concentración.

Habiendo observado un aumento de la expresión del gen IFNG tras la estimulación con mi-IL2, quisimos determinar los niveles del producto genético, interferón-γ (IFNγ), en el sobrenadante de los cocultivos. El IFNγ es una citoquina importante para las respuestas antitumorales mediadas inmunológicamente. El IFNγ puede afectar directamente a las células tumorales ejerciendo efectos antiproliferativos y antiangiogénicos, así como indirectamente aumentando la actividad tumoricida de los macrófagos y atrayendo otras células inmunes40. Cuantificamos los niveles de IFNγ en los medios condicionados del cocultivo de PBMC y esferoides tumorales. De acuerdo con los resultados de la expresión génica, los niveles de IFNγ aumentaron con la estimulación con IL-2 purificada de forma dosis dependiente (Fig. 2D). Sin embargo, las células estimuladas con mi-IL2 produjeron tres veces más INFγ, en comparación con 10 ng/ml de IL-2 purificada. Estos resultados indican que mi-IL2 tiene un efecto activador de células inmunitarias más fuerte.

Se investigó el efecto antitumoral de la cepa EcN que expresa mi-IL2 (EcN mi-IL2) en ratones CB6F1 portadores de tumores. Los ratones con tumores CT26 se trataron con una única inyección intravenosa de PBS, bacterias EcN que no expresan (EcN Ctrl) o EcN mi-IL2 (Fig. 3A). Aunque no se observó un fuerte efecto antitumoral, el análisis transversal indicó que los ratones tratados con EcN mi-IL2 tenían tumores más pequeños en los días 2 y 4 (Fig. 3B). El análisis longitudinal con un modelo de regresión lineal indicó un crecimiento tumoral más lento en los animales tratados con EcN mi-IL2, pero no en el grupo EcN Ctrl (Fig. 3C).

EcN mi-IL2 ralentiza el crecimiento de los tumores CT26. Los ratones CB6F1 que albergaban tumores CT26 en ambos flancos se trataron con PBS o 1 × 108 UFC de bacterias por vía intravenosa. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron los 2000 mm3. (A) Diseño del estudio. Figura realizada mediante biorender bajo el acuerdo Número YB25KBCY7U. (B) Volúmenes tumorales CT26 de todos los ratones tratados con PBS (n = 12), EcN Ctrl (n = 6) y EcN mi-IL-2 (n = 8). Se muestra el volumen tumoral medio con SEM. Significancia determinada con ANOVA y análisis post-hoc de comparación entre grupos mediante la prueba de Diferencia Significativa Honesta de Tukey: (ns) p > 0,05, *p ≤ 0,05. (C) Análisis longitudinal de la tasa de crecimiento de los tumores utilizando un modelo de regresión lineal. Se muestra el intervalo de confianza del 95% de las estimaciones de los coeficientes. La interpretación del resultado del modelo es el cambio en la tasa de crecimiento de los tumores en comparación con el grupo PBS. (D) Niveles de IL-2 en tumores colonizados con media y SEM mostrados.

Experimentos anteriores mostraron que la cepa EcN mi-IL2 tenía una carga metabólica mínima, en comparación con WT EcN; por lo tanto, esperábamos que la eficiencia de la colonización del tumor fuera similar a la de la cepa EcN Ctrl. Sin embargo, observamos una menor colonización de EcN mi-IL2 en comparación con EcN Ctrl. Todos los tumores fueron colonizados en el grupo EcN Ctrl, mientras que solo la mitad de los tumores tenían bacterias detectables en el grupo EcN mi-IL2 (Figura complementaria S3).

La producción de mi-IL2 en el microambiente tumoral es importante para observar un efecto terapéutico. Se homogeneizaron los tumores que tenían colonización bacteriana y se midieron los niveles de IL-2. Los niveles de IL-2 se midieron en todos los tumores PBS y en los tumores colonizados de los grupos EcN Ctrl y mi-IL2. Como se esperaba, los niveles de IL-2 entre los grupos PBS y EcN Ctrl no fueron diferentes (Fig. 3D), mientras que los niveles de IL-2 fueron significativamente más altos en los tumores del grupo ECN mi-IL2, con un aumento de ~ dos veces en la concentración de intra- IL-2 tumoral.

Para evaluar si EcN mi-IL2 tuvo un impacto en la composición de las células inmunitarias del modelo de ratón CT26, realizamos un análisis de fenotipado en células inmunitarias aisladas de bazos y tumores (anticuerpos enumerados en la Tabla 4). No hubo diferencias en la población de células B o NK entre los grupos en el bazo ni en los tumores (Figura complementaria S4A, B). Sin embargo, el número de células T CD4+ en los tumores fue mayor en los grupos EcN Ctrl y EcN mi-IL2, en comparación con PBS (Figura complementaria S4B). Además, hubo una disminución de las células T CD8+ en el grupo EcN Ctrl. Se observaron niveles elevados de células T de memoria central CD4 + y células T de memoria efectora en los bazos del grupo EcN mi-IL-2 (Figura complementaria S4C). En los tumores, los niveles de células T CD4+ fueron similares entre los grupos PBS y EcN mi-IL-2, pero disminuyeron en el grupo EcN Ctrl (Figura complementaria S4D). La diferenciación de células T CD8 + no fue diferente entre los grupos de bazo y tumores (Figura complementaria S4E, F).

Las bacterias diseñadas para la producción local de compuestos bioactivos son un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer41,42,43, en particular para las citocinas que son demasiado tóxicas para la administración sistémica. Sin embargo, en ciertos casos puede resultar complicado expresar niveles terapéuticos de citoquinas biológicamente activas en bacterias44,45. El correcto plegamiento de proteínas y las modificaciones postraduccionales son cruciales para conservar su actividad biológica. Por lo tanto, optimizamos una cepa terapéutica de EcN para la producción y administración in situ de IL-2 biológicamente activa. Fueron necesarias modificaciones del péptido señal y de la etiqueta de solubilidad para obtener niveles más altos de IL-2 activa (Fig. 1). Utilizamos un ensayo celular con células CTLL-2 para determinar la actividad de IL-2 en los sobrenadantes. En cada paso de la optimización, la producción total de IL-2 se comparó con los niveles de actividad utilizando el ensayo in vitro. Nuestros resultados muestran que una mayor producción de IL-2 no necesariamente aumenta la cantidad de IL-2 activa en el sobrenadante. Esto podría explicarse por un cuello de botella en el plegamiento correcto o en la formación de enlaces disulfuro, lo que da como resultado más proteína inactiva. Estos hallazgos resaltan la importancia de ajustar los niveles de expresión en microbios terapéuticos para administrar proteínas biológicamente activas.

En nuestro estudio, empleamos péptidos señal dependientes de SecB para facilitar la translocación de proteínas al periplasma. Aunque este enfoque se usa comúnmente para la producción de proteínas extracelulares, el mecanismo preciso que subyace al movimiento de mi-IL2 hacia el ambiente extracelular sigue siendo difícil de alcanzar. Estudios anteriores han informado que las proteínas que transportan estos péptidos señal pueden localizarse fuera de la célula de manera dependiente de SecB29,46. Si bien la lisis bacteriana surge como una vía plausible para que mi-IL2 acceda al entorno extracelular, no observamos efectos adversos notables sobre el crecimiento o la aptitud de la cepa mi-IL2 en comparación con el control de EcN (Figura complementaria S1). Los estudios futuros para optimizar la administración microbiana de péptidos y proteínas terapéuticos requerirán una mejor comprensión del mecanismo preciso por el cual las proteínas se translocan al entorno extracelular.

Una consideración adicional al diseñar un microbio terapéutico es la aptitud y viabilidad de la cepa. En un microbio terapéutico, los recursos que podrían utilizarse para el crecimiento se redirigen a la producción de proteínas heterólogas, lo que aumenta la carga metabólica. A su vez, esto puede resultar en un crecimiento más lento y una menor condición física47. La disminución de la aptitud puede impedir la capacidad de las bacterias para sobrevivir y colonizar dentro del huésped y en el microambiente del tumor. Por lo tanto, en este trabajo tomamos en consideración el costo de aptitud física de la cepa durante el proceso de optimización (Figura complementaria S1), con el objetivo de equilibrar los niveles de proteína bioactiva heteróloga y el costo de aptitud física de la cepa.

Utilizando nuestro ensayo de cultivo celular en 3D, pudimos demostrar que la IL-2 microbiana es más potente que la proteína purificada. Los mismos genes diana estaban regulados positivamente en mi-IL2 y en la IL-2 purificada (Fig. 2C), lo que indica que el mecanismo de acción depende de la IL-2. Sin embargo, mi-IL2 mostró un efecto más fuerte en la activación de las células inmunes que la IL-2 purificada, aunque los niveles de proteína eran diez veces más bajos. Los medios condicionados de bacterias no solo contienen IL-2, sino también otras moléculas inmunogénicas derivadas de bacterias, como el lipopolisacárido (LPS), que puede actuar como adyuvante. Se ha informado que el LPS funciona sinérgicamente con la IL-2 para mejorar la producción de IFNγ y la citotoxicidad48. Por tanto, el efecto aditivo de la IL-2 producida bacterianamente junto con el LPS y otras moléculas inmunogénicas podría mejorar la respuesta terapéutica.

El tratamiento con EcN mi-IL2 no tuvo un fuerte efecto terapéutico en ratones con tumores CT26. Algunos tumores tratados con EcN mi-IL2 no respondieron al tratamiento y esto resultó en una mayor variabilidad. Sin embargo, se observó un crecimiento tumoral más lento en los primeros momentos y niveles más altos de IL-2 en los tumores (Fig. 3). Se ha informado anteriormente que la infección por E. coli TOP10 y EcN de ratones BALB/c con tumores CT26 conduce a una eliminación del tumor mediada por células T CD8+24,49. En nuestro modelo de ratón CB6F1, vimos una disminución de células T CD8+ intratumorales en ratones tratados con EcN que no expresa (EcN Ctrl), mientras que los ratones del grupo EcN mi-IL2 tenían los mismos niveles de células T CD8+ totales que el grupo PBS. (Figura complementaria S4B). Es posible que en nuestro modelo de ratón las células T CD8+ no se activen tras la infección con bacterias, como se observa por el modesto efecto terapéutico de la cepa. Finalmente, la administración de citoquinas al microambiente tumoral se verá afectada por la baja colonización del tumor, lo que afectará la eficacia terapéutica del tratamiento. Nuestra hipótesis es que una cepa con un mejor perfil de crecimiento daría como resultado una colonización estable del microambiente tumoral. Por ejemplo, la cepa EcN Ctrl exhibió una colonización de tumores muy estable durante todo el experimento. Por el contrario, la cepa EcN mi-IL2 mostró una colonización tumoral disminuida (Figura complementaria S3), aunque el perfil de crecimiento fue similar al de la cepa EcN Ctrl (Figura complementaria S2). Desafortunadamente, los perfiles de crecimiento en el laboratorio no pueden recrear completamente las condiciones que influyen en la supervivencia bacteriana en el microambiente del tumor. Además, la expresión de citocinas que activan las células inmunitarias también podría tener un impacto en la colonización bacteriana. Por ejemplo, se ha informado que la actividad bactericida de los macrófagos contra S. typhimurium aumentó con la estimulación con IL-250. Quizás las bacterias que expresan citocinas promuevan su propia eliminación activando macrófagos u otras células que matan bacterias. No está claro si la mala colonización del tumor se debe a la carga metabólica causada por la expresión de citocinas o al impacto inmunológico de las citocinas. Se necesita más investigación para identificar los efectos específicos que causan este fenómeno, pero la administración bacteriana repetida podría ser una posible solución.

La administración intratumoral de IL-2 se ha estudiado previamente con S. typhimurium con resultados preclínicos prometedores21. Sin embargo, S. typhimurium productor de IL-2 no tuvo un efecto significativo en los ensayos clínicos51. Otra advertencia es que S. typhimurium es una bacteria patógena que requiere atenuación52. También se han explorado otros chasis bacterianos para la administración de IL-2, incluidas las especies de Clostridium; sin embargo, en esos estudios no se demostró la eficacia para el tratamiento del cáncer in vivo22,23. Además, estos estudios no optimizaron la mayor actividad de IL-2 en los sobrenadantes bacterianos, ni el costo óptimo de aptitud física de la cepa. Como hemos demostrado en nuestro trabajo, una mayor producción total de IL-2 fuera de la célula no necesariamente da como resultado una IL-2 más activa. Además, diferentes péptidos señal o la adición de etiquetas de solubilidad no solo cambian la producción de IL-2 activa en el sobrenadante, sino también el costo de aptitud física de la cepa. Por lo tanto, sostenemos que las cepas deben optimizarse para obtener la mayor actividad de IL-2 y no para los niveles totales de IL-2 encontrados en los sobrenadantes.

En este trabajo demostramos la viabilidad de EcN para la administración de IL-2 in situ como un posible tratamiento de inmunoterapia. Aunque la IL-2 se ha expresado anteriormente en E. coli, hasta donde sabemos, este es el primer trabajo que demuestra la administración intratumoral de IL-2 para la terapia del cáncer. Sin embargo, se necesita una mayor optimización para lograr un efecto terapéutico más fuerte. Las aplicaciones futuras pueden incluir una mayor optimización de las cepas, circuitos genéticos más complejos que utilicen biosensores53 o la coexpresión de otros péptidos terapéuticos que podrían ejercer un efecto anticancerígeno sinérgico. Aunque el camino hacia las aplicaciones clínicas todavía plantea varios desafíos, este trabajo beneficiará a la sociedad al acercarnos a una administración más segura y específica de terapias para tratar enfermedades de una manera transformadora y orientada a objetivos.

Se utilizó el plásmido pMut1 nativo de E. coli Nissle 1917 para la expresión de las citoquinas. El plásmido ha sido modificado previamente para insertar un gen de resistencia a la kanamicina para la selección de antibióticos. La estructura principal del plásmido se amplificó por PCR con la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion con cebadores, que codificaban el promotor, el péptido señal o la etiqueta de solubilidad relevante (Tablas 1, 2). Los fragmentos de PCR producirían protuberancias de 20 a 25 nt con las secuencias de ADN que codifican las citocinas. Las secuencias de ADN que codifican las citoquinas se tomaron de UniProt. El gen IL-2 se optimizó con codones para E. coli y se sintetizó mediante IDT. Las construcciones se clonaron en el plásmido pMut1 usando un ensamblaje Gibson según las recomendaciones del fabricante. Después del ensamblaje de Gibson, los plásmidos se transformaron en la cepa TOP10 de E. coli utilizando células electrocompetentes o químicamente competentes. Se seleccionaron las cepas correctas mediante PCR de colonias y secuenciación de Sanger. Los plásmidos se purificaron a partir de bacterias TOP10 y se transformaron en bacterias E. coli Nissle 1917 electrocompetentes para producir la cepa final que expresa citoquinas.

El medio se complementó con FBS al 10 % y 50 µg/ml de kanamicina. Se utilizó medio RPMi para preparar sobrenadantes para el ensayo de actividad de IL-2. Se utilizó medio 5A de McCoy para preparar sobrenadantes para el ensayo de citotoxicidad de esferoides tumorales 3D. Se inoculó una única colonia bacteriana en medio RPMi o McCoy's 5A y se cultivó durante la noche a 37 °C con agitación a 250 RPM. Los cultivos nocturnos se diluyeron 100 veces en medios nuevos y se cultivaron hasta la fase exponencial tardía. Los cultivos se centrifugaron a 4000 xg durante 10 minutos y los sobrenadantes se esterilizaron por filtración utilizando un filtro de jeringa de 0,22 µm. Los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C para su uso posterior.

Los sobrenadantes de cultivos celulares o bacterianos se diluyeron en tampón de dilución ELISA y los niveles de citoquinas se midieron con un kit ELISA comercial (Abcam ab46033) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las células de mamífero se mantuvieron en matraces T75 y se subcultivaron cada 3 a 4 días. Los medios de crecimiento completos contenían un 10% de FBS y un 1% de cóctel de antibióticos. Se cultivaron células CTLL-2 (RRID: CVCL_0227) en medio RPMi completo suplementado con un suplemento de cultivo de células T al 10 % con ConA (Thermofisher Scientific 11513540). Se cultivaron células CT-26 (RRID:CVCL_7254) en medio RPMi completo. Se cultivaron células HT29 (RRID:CVCL_A8EZ) en medio McCoy's5A completo. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.

Las células CTLL-2 se centrifugaron a 200 G durante 5 minutos y se lavaron dos veces con PBS para eliminar el suplemento de cultivo de IL-2 del medio. Las células quedaron privadas de IL-2 incubándolas en medio RPMi completo sin IL-2 durante 5 a 6 h. Se colocaron 2 x 104 células en un volumen de 45 μl en cada pocillo de una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos. Se añadieron a las células 45 µl de sobrenadantes diluidos a una concentración final del 10% (V/V). Como control positivo se utilizó medio con 5% de cultivo de células T suplementado con ConA, debido a que contiene IL-2. Después de 16 h, se agregaron 10 μl de azul Alamar (Thermofisher Scientific, DAL1025) y se incubaron durante 30 min. La intensidad de la fluorescencia se midió a 530 nM de excitación y 560 nM de longitudes de onda de emisión.

Se obtuvieron capas leucocitarias humanas frescas de voluntarios anónimos sanos en el banco de sangre del Departamento de Inmunología Clínica, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca. Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando tubos Lymphoprep y SepMate-50. El aislamiento se realizó según las recomendaciones del fabricante. Las PBMC congeladas se almacenaron para su uso posterior. Las PBMC se utilizaron inmediatamente después de la descongelación.

Se sembraron 5000 células HT-29 en una microplaca de fijación ultrabaja transparente de 96 pocillos (Thermofisher Scientific, 10023683) y se centrifugaron a 1000 xg durante 10 minutos y se colocaron en la incubadora para formar esferoides. Se cocultivaron esferoides tumorales de 4 días con 1 × 105 PBMC humanas y sobrenadantes de bacterias (30% V/V) en un volumen de 100 μl. Se utilizó IL-2 recombinante humana como control positivo (Thermofisher Scientific, PHC0026). Se añadió 1 µl de tinte verde Cytotox diluido 30 × (Essen Biosciences, ESS4633) por pocillo y se midió la citotoxicidad hasta 72 h utilizando el sistema de imágenes de células vivas Incucyte S3. Se tomaron imágenes de integridad de esferoides después de 72 h de incubación. Los cocultivos se pipetearon suavemente hacia arriba/abajo 5 veces para perturbar las células sedimentadas y las imágenes se adquirieron inmediatamente con el sistema Incucyte.

Se incubaron PBMC humanas o esferoides tumorales + PBMC con sobrenadantes bacterianos o IL-2 recombinante (Thermofisher Scientific, PHC0026) durante 24 h. El ensayo se realizó utilizando 12 pocillos de una microplaca de fijación ultrabaja transparente de 96 pocillos para cada condición. Las células se agruparon en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 xg durante 10 minutos. El sobrenadante se congeló y se usó para analizar la secreción de INFγ con un kit ELISA comercial (Thermofisher Scientific, 02002) y las células sedimentadas se resuspendieron en TRIzol. Se extrajo el ARN (Zymo research, R2072) y se realizó una reacción de transcripción inversa (Thermofisher Scientific 11756050) según las recomendaciones de los fabricantes. El ADNc se diluyó 6 veces con agua MiliQ. Se realizaron reacciones de qPCR de 3 pasos mezclando 6 µl de la mezcla maestra de qPCR 2 × (Merck, KK4602), 2 µl de ADNc y 2 µl de cebadores de qPCR (3 µM) (Tabla 3).

Todos los protocolos de experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices danesas para el bienestar animal. El consejo de experimentación con animales de la inspección danesa de experimentación con animales ha aprobado los protocolos del estudio con la licencia experimental n.º. 2017-15-0201-01209. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE. Los ratones CB6F1 se compraron en Envigo. Las células CT26 se lavaron 3 veces en PBS y se inocularon 5 x 105 células en cada flanco de los ratones. Se midieron los tamaños de los tumores y se calculó el volumen según la fórmula \(\frac{3.14}{6}\times {D1\times D2}^\frac{3}{4}\), donde D1 y D2 son Dimensiones en milímetros. Después de 10 a 12 días, cuando los tumores se formaron y alcanzaron al menos un tamaño de 100 mm3, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa PBS o 1 × 108 UFC de bacterias en un volumen de 100 μl. Los volúmenes de los tumores y el peso del ratón se midieron 3 veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un volumen de 2000 mm3. Debido al rápido crecimiento de algunos tumores, algunos ratones excedieron el límite de 2000 mm3 tras la inspección y fueron sacrificados inmediatamente. Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical y se diseccionaron tumores y órganos. Los tumores disecados se cortaron en trozos pequeños y se dividieron en dos tubos para analizar los niveles de citocinas de colonización tumoral y la inmunofenotipificación.

Después de la disección de partes de los tumores de tamaño uniforme, la mitad del bazo o el hígado completo se colocaron en tubos GentleMACS C y se homogeneizaron utilizando el programa m_Imptumor_01_01. Los grupos de células se eliminaron forzando las muestras homogeneizadas a través de un filtro celular de 70 μm. Se colocaron diluciones en serie de los homogeneizados de órganos en placas LB que contenían kanamicina y se contaron las UFC bacterianas al día siguiente. Para cuantificar los niveles de citoquinas expresadas en los tumores, los mismos homogeneizados de órganos se centrifugaron a 5000 xg durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 17.000 xg durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se almacenó a -80 °C. Se realizó ELISA con sobrenadantes diluidos al doble para medir la IL-2 en los tumores. ELISA (Abcam ab46033) se realizó según las recomendaciones del fabricante.

Para la digestión del tumor, se incubaron 50 µl de ADNasa I (Sigma-Aldrich, 11284932001) (stock 600 U/ml) y 0,5 ml de colagenasa IV (Thermofisher Scientific, 2525) (stock 10 mg/ml) con pequeños trozos de tumor en su totalidad. DMEM en un volumen total de 5 ml. La digestión se llevó a cabo a 37 °C durante 45 min con agitación intensa. Los bazos se homogeneizaron con tubos GentleMACS C como se analizó anteriormente. Los grupos de células se eliminaron forzando las muestras homogeneizadas a través de un filtro celular de 70 μm. Las células se lavaron con PBS 3 veces y las células se congelaron a 1 x 107 células viables por criotubo. El medio se complementó con DMSO al 10% y se utilizó medio RPMi para bazos y medio DMEM para células tumorales.

Las células congeladas de tumores o bazos se descongelaron rápidamente con medio RPMi completo tibio y se transfirieron inmediatamente a un tubo Falcon de 15 ml con 9 ml de medio RPMi tibio. Las células se centrifugaron a 1500 RPM durante 5 minutos a 4 ° C y se lavaron con tampón de selección (1x PBS, 2% FBS, EDTA 1 mM). Las células se filtraron a través de un tubo con filtro FACS y se realizó una selección positiva de CD45 (StemCell Technologies, 18945) solo en las células tumorales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la selección, las células se lavaron con tampón FACS (1x PBS, 2% FBS) y se transfirieron a una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron con 10 µl de bloque Fc en hielo durante 10 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con tampón FACS y se incubaron con el panel de anticuerpos (Tabla 4) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se fijaron con 50 µl de PFA durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las células se lavaron con tampón FACS dos veces y se filtraron a través de una placa de filtración antes de pasarlas al citómetro de flujo. La estrategia de activación se indica en la figura complementaria S5.

Los datos de citometría de flujo están disponibles en la base de datos FlowDepository. Se puede acceder a los archivos de citometría de flujo para el inmunofenotipado del bazo siguiendo el enlace http://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z6KG. Se puede acceder a los archivos de citometría de flujo para el inmunofenotipado del tumor siguiendo el enlace http://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z6KH. Otros datos están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes.

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Los autores quieren agradecer al animalario DTU por apoyar los estudios con animales. Quieren agradecer a la Fundación Novo Nordisk por apoyar esta investigación con el programa Challenge CaMiT bajo el número de subvención NNF17C0028232.

Centro de Biosostenibilidad de la Fundación Novo Nordisk, Universidad Técnica de Dinamarca, Lyngby, Dinamarca

Sarunas Tumas, Troels Holger Vaaben, Annemette Tengstedt Rasmussen, Rubén Vázquez-Uribe y Morten OA Sommer

Departamento de Tecnología Sanitaria, Universidad Técnica de Dinamarca, Lyngby, Dinamarca

Trine Sundebo Meldgaard, Sara Suárez Hernández y Sine Reker Hadrup

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

ST, ATR y THV realizaron clonación y optimización de cepas. ST y TSM realizaron el estudio en animales. SSH realizó inmunofenotipado. ST, RVU, MOAS, SRH planificaron experimentos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Morten OA Sommer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Thomas, S., Meldgaard, TS, Vaaben, TH et al. Diseñó E. coli Nissle 1917 para la administración de IL-2 bioactiva para inmunoterapia contra el cáncer. Representante científico 13, 12506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39365-2

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Recibido: 04 de enero de 2023

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39365-2

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